2018年世界卫生组织发布的数据里，全球有960万人因为癌症死亡，其中每8位男性或11位女性中就有1人死于癌症1。在我国，每年新发现的癌症病人中，肺、肠和肝癌几乎涵盖了近40%的病例2。由于早期癌症通常缺乏明确的症状，大多数患者就诊时已是中晚期。以肺癌为例，尽管不断进步的治疗手段使早期患者的预后显著改善，但晚期患者五年生存率仅有5% 3。低剂量螺旋CT（LDCT），肠镜和腹部B超是美国国家综合癌症网络指南（NCCN guidelines）推荐的肺癌、肠癌和肝癌高危人群筛查方法，但出于普及性，便捷性等考虑，全球医疗科学工作者仍在不断努力，力图开发更加准确，简便的早期检测方法。
循环肿瘤DNA（ctDNA）是肿瘤生长过程中，不断脱落在血液中的“碎片”。这些碎片将深埋在体内的肿瘤信息，变得常规抽血就能获得。这样的“现场直播”，为多种癌症的无创诊断、监控和预后，提供了强大的应用前景。然而在肿瘤的早期阶段，脱落到血液中的成分异常微量，在海量的正常游离DNA（cfDNA）碎片干扰下，如何准确的捕捉肿瘤特征信号成为领域内著名的技术难题。
针对“大海捞针“的技术挑战，燃石研发团队在各种早期肿瘤标志物中，采用了DNA甲基化作为突破口。和肿瘤基因突变相比，DNA甲基化具有如下特点：
(1) “早”：肿瘤发生早期已有显著变异；
(2) “多”：变异位点数目丰富，通常可达突变的数百倍；
(3) “集中”：变异多发在特定区域，适合靶向富集；
(4) “特异”：来自不同器官的甲基化信号不同，使预测肿瘤的来源成为可能。
1月13-17日在美国迈阿密举行的2020年AACR液体活检峰会上（Advances in Liquid Biopsies），来自全球顶尖院校，医院和科技企业的团队（斯坦福大学，约翰霍普金斯大学，麻省总医院，斯隆-凯特琳医院，GRAIL等）分享了他们在液体活检领域最新的技术探索和临床应用。
燃石壁报为参会专家展示了针对肺癌、肠癌和肝癌，不同ctDNA检测技术的研究数据。
其中ELSA-seq, 一种燃石自主开发的高敏感甲基化变异分析技术，作为主要研究方法汇报，并在一个子研究中，和基于分子标签的超深突变测序（HS-UMI）以及数字微滴PCR（ddPCR）进行多平台平行验证。结果表明：采用机器学习进行单分子甲基化信号分析的ELSA-seq，在多癌种的无创检测上具有令人兴奋的应用前景！
ELSA-seq的敏感性突破来自于实验方法和生物信息学的双重提升：高效的模板利用和转化效率使得最少仅需500pg的cfDNA，即可成功制备全甲基化组测序文库。通过高效的探针捕获，富集包含80，672个癌症相关位点的区域，并进行深度测序。对比传统甲基化测序，ELSA-seq在化学，酶学，信息学等多个层面进行降噪，从而产生高清甲基化变异图谱。最后采用机器学习搭建高纬分类模型，实现了血液中早期肿瘤稀疏信号的有效识别。
燃石研发、医学和运营团队继去年和北京协和医院合作完成技术开发和单癌种POC（proof-of-concept）研究后，此次和上海胸科医院、上海长海医院和中南大学湘雅二院合作，将ELSA-seq扩展到多癌种验证研究。目前本研究已纳入716名参与者的血液样本，其中肿瘤组包含肺癌患者178人，肠癌187人，肝癌125人，对照组包含226名无症状健康人（年龄性别匹配），其中早期患者（I-III期）占肿瘤队列的82%。
本研究的主要特点为：
1、队列平衡设计：不论是DNA突变还是甲基化，都随着年龄增长变异数目增多程度加深。如果不进行匹配设计，年长的肿瘤病人vs年轻的健康人（如常规体检人群）会表现出异常好的区分度，然而这并不（全）是肿瘤信号的识别，而是受“年龄钟”效应影响。本研究肿瘤组平均年龄56岁（41-74岁），对照组平均年龄53岁（48-79岁），男女比例近似（肝癌除外），支持研究的客观性和有效性。
2、过拟合风险控制：稀疏信号需要的高维建模，不可避免的带来过拟合风险，这在biomarker研究中是重中之重，否则模型无法泛化，临床价值有限。本研究采用多中心入组，不同癌种按预先设计的比例随机分隔成训练和验证组，彼此完全独立。模型训练阶段采用多次重复交叉验证，并在数据预处理，特征构建，参数优化等各个环节对过拟合风险进行评估和判罚。同时Case和Control同批处理同时测序，最大程度控制批次效应。
3、痕量污染风险控制：早期病人血液中肿瘤信号非常微弱，微量污染即有可能产生“假阳”。针对这种危险，本研究采用严格场地区分和自动化工作站（automated workstation）减少人工操作，并通过in-house分析模块对污染风险进行监控和过滤。
本研究的主要发现为：
在肺，肠，肝三个癌种，ELSA-seq表现出81%的综合敏感性和95%的综合特异性，并且在独立验证集中正确预测93%癌症样本器官来源，预示着巨大的应用潜力。在肺癌亚组子研究中，和基于分子标签的超深突变测序HS-UMI相比，ELSA-seq成功检测出几乎多一倍的患者，且联合检测可以进一步提高准确性，支持未来多组学整合的技术开发前景。具体细节如下：
1、从分期（cancer stage）看，检出率和疾病进展相关：I-IV期患者分别显示出65%，82%，88%和94%的敏感性，表明ctDNA甲基化水平在各阶段都可作为良好的肿瘤标志物。和文献报道的传统血清蛋白标志物相比，ELSA-seq显示了优异的综合特异性（95.1%，95CI：91.2-97.4%），这对于发病率低的疾病（如肿瘤），控制过高阳性预测值（PPV）和降低过度诊疗风险有重要价值。
2、从癌种（cancer type）看，不同癌种区别显著，I期尤为明显：I-IV期，肺癌（敏感性34.1-93.9%，特异性96.0%），肠癌（敏感性76.3-95.7%，特异性96.9%），肝癌（敏感性82.4-100%，特异性99.6%）。以肺癌为例，I期和II期敏感性相差近似一倍（34.1% vs 72.3%），表明血液肿瘤丰度（tumor burden）依然是I期敏感性的主要限制因素。有研究表明，这三个癌种在I期的血液丰度可以相差高达百倍，巧合地是，这和本次会议提出划分“poor-shedder”（ctDNA稀少，如肺腺癌，前列腺癌），和“high-shedder”（ctDNA丰富，如肝癌，胃癌）癌种的概念一致。
3、从亚型（pathological subtype）看，不同病理亚型差异巨大：例如TRACERx研究曾经在Nature报道4，I期肺鳞癌（LUSC）的ctDNA突变检出率显著高于肺腺癌（LUAD），并推测和肿瘤生长速度大小等因素有关。本研究中肺癌I期主要为腺癌构成，其中I期腺癌检出31%（11/35），鳞癌检出60%（3/5）。这个结果呼应了GRAIL在2019 ESMO公布的肺癌分型结果：I期腺癌检出为0%（0/37），鳞癌检出50%（8/16）。体现了即使分期相同，不同亚型对检测结果的巨大影响。
4、从定位（tissue-of-origin）看，ELSA-seq显示出优越的组织溯源能力：在验证集中93%癌症样本被准确定位（117/126）。其中对肺癌，肠癌，肝癌的定位能力依次升高（84%，95%，98%）。III-IV期的准确性比I-II期略高，推测和信号强度有关。
5、从检测手段（cross-platform comparison）看，本研究包含了一个由32个I-III期肺癌和21个同年龄健康人的方法学对比子研究。其中突变检测为了去除克隆造血（clonal hematopoiesis）造成的干扰，血浆和配对WBC都进行了~35，000X的超深测序。原发肿瘤测序结果作为金标准指导患者特异的ddPCR设计。研究结果表明，在同等“零假阳“（0/21） 的情况下，ELSA-seq比HS-UMI检出多近乎1倍的病人（27/32 vs 15/32），并在0.02%肿瘤丰度上被ddPCR验证）。
2019年5月13日，美国药品食品监督管理局（FDA）宣布GRAIL公司的多癌种无创检测技术创新审评通过（Breakthrough Device Designation），显示了国家监管机构对于多癌种早期无创检测技术开发的重视和认可。同年Guardant Healthy公布了基于ctDNA甲基化和突变联合检测肠癌的突破性成果（I-III期敏感性76-95%，特异性94%），其中甲基化作为主要衡量标准。
任何技术从科学研究到临床应用都需要走过一条漫长严谨的验证之路，燃石医学将持续在技术开发与大型临床验证上发力。希望在不久的未来，可以和全球的同行一起，开启肿瘤检测和诊疗的新篇章。
燃石CTO张之宏博士（左）和研发总监李冰思博士（右）
参考文献
1. Bray, F. et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin 68, 394-424 (2018).
2. Feng, R. et al. Current cancer situation in China: good or bad news from the 2018 Global Cancer Statistics? Cancer Commun 39(1):22 (2019).
3. Groot, P. et al. The epidemiology of lung cancer. Transl Lung Cancer Res.7(3): 220-233 (2018).
4. Abbosh, C. et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early stage lung cancer evolution. Nature 545(7655): 446-451 (2017).
关于美国癌症研究协会.液体活检峰会（AACR Advances in Liquid Biopsies）
AACR是全球肿瘤医疗领域影响力最大的会议之一，每届都会涵盖从癌症早期研究到临床应用的最新发现，并展示世界各地研究和医学机构的卓越工作成果。其旗下包含多个分会，针对不同细分领域的最新进展进行第一时间播报，旨在推进前沿医疗科技的创新和发展。